RESUMO
O iodo é transportado para a célula tireoideana através do simportador sódio-iodo (NIS). Estudo anterior de nosso grupo mostrou que a expressão do RNAm de NIS estava reduzida nos tecidos tumorais (T) tireoideanos quando comparada à dos tecidos não tumorais (NT) adjacentes. A metilação de ilhas CpG localizadas em promotores é um dos mecanismos epigenéticos que regula a expressão gênica. Já foi demonstrado que a metilação aberrante desempenha papel importante na tumorigênese humana, porém, estudos qualitativos não conseguiram definir um padrão de metilação do promotor de NIS no câncer diferenciado de tireóide. Assim, o presente estudo visou (1) investigar o padrão de metilação do promotor do gene NIS em amostras T (benignos e malignos) e NT adjacentes, e correlacionar o grau de metilação com os valores de RNAm, e (2) identificar novas sequencias regulatórias, alvos de metilação do DNA, que pudessem também modular a expressão de NIS. Foram estudados 30 pares de amostras de tecido tireoideano T e NT adjacente, sendo 10 benignos e 20 malignos. Também foi avaliado um par de amostras de paciente com nódulo maligno com alta captação de iodo (hipercaptante). A metilação da ilha1 CpG foi avaliada por PCR Metilação Específica (MSP) semiquantitativa e a metilação da ilha2 CpG foi analisada por bissulfito seqüenciamento; ambas com DNA bissulfito convertido. Novas ferramentas de bioinformática foram utilizadas na análise in silico para identificar ilhas CpG funcionais na região 5' upstream da seqüência promotora de NIS. Plasmídios foram construídos contendo o fragmento de DNA da Ilha2 CpG na frente de gene reporter (luciferase) e usados em transfecções de células HEK293 para avaliar a atividade regulatória desta ilha...
Iodide is transported from the blood into thyroid cell through the sodium iodide symporter (NIS). We have previously detected reduced NIS mRNA expression in thyroid tumoral tissue (T) when compared with the non tumoral tissue (NT). Methylation of DNAs CpG islands, very common in promoters, is an epigenetic alteration that regulates gene expression. Aberrant gene methylation plays an important role in human tumorigenesis. Previous qualitative studies have failed to define a NIS promoter methylation pattern in thyroid cancer. This study aimed (1) to investigate the methylation pattern of the NIS gene promoter in thyroid tumors (benign and malignant), and to correlate the methylation status with cellular levels of NIS mRNA, in T and adjacent NT samples; (2) to identify new regulatory DNA sequences that could modulate NIS gene expression by methylation of the DNA. Thirty pairs of thyroid samples (tumoral and non-tumoral), 10 benign and 20 malignant tumors were included. A pair of samples of a malignant nodule with high iodide uptake was also included. Methylation of CpG Island1 was evaluated by semiquantitative Methylation Specific PCR (MSP) and methylation of CpG island2 was analyzed by bisulfite sequencing; both using bisulfite converted DNA. New bioinformatic tools were used in in silico analysis to identify functional CpG islands in the 5 upstream region of the NIS promoter. Plasmids were constructed containing the CpG island2 DNA fragment in front of a reporter gene (lucyferase) and used in transfections assays of HEK293 cells to assess the regulatory activity of this island. Tumor thyroid cell cultures with low NIS expression were treated with the demethylating agent 5Aza and NIS mRNA expression was quantified by real time PCR. Methylation of CpG island1 was detected in all the samples (NT and T) of benign and malignant group, no differences were observed in the methylation degree between the groups...
